Продукты
Набор Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR для обнаружения 2019-nCoV
Ожидаемое использование
Этот набор используется для качественного выявления нового коронавируса (2019-nCoV) с использованием мазков из зева, носоглотки, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, мокроты. Результат обнаружения этого продукта предназначен только для клинической справки, и его не следует использовать в качестве единственного данные для клинического диагноза и лечения. Рекомендуется комплексный анализ состояния в сочетании с клиническими проявлениями пациента и другими лабораторными исследованиями.
Принцип проверки
Набор основан на технологии одноэтапной ОТ-ПЦР.Фактически, гены ORF1ab и N нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) были выбраны в качестве целевых областей амплификации.Специфические праймеры и флуоресцентные зонды (зонды гена N помечены FAM, а зонды ORF1ab помечены HEX) предназначены для обнаружения РНК коронавируса нового типа 2019 в образцах.В комплект также входит эндогенная система обнаружения внутреннего контроля (зонд гена внутреннего контроля, помеченный CY5) для мониторинга процесса сбора образцов, амплификации РНК и ПЦР, что снижает ложноотрицательные результаты.
Основные компоненты
| Компоненты | Объем（48 т/комплект） |
| Реакционный раствор для ОТ-ПЦР | 96 мкл |
| Смесь зондов TaqMan для праймеров nCOV (ORF1ab, ген N, ген RnaseP) | 864 мкл |
| Отрицательный контроль | 1500 мкл |
| nCOV Положительный контроль (l ORF1ab N Gene) | 1500 мкл |
Собственные реагенты: реагенты для выделения или очистки РНК.Отрицательный/положительный контроль: положительный контроль представляет собой РНК, содержащую целевой фрагмент, а отрицательный контроль представляет собой воду, не содержащую нуклеиновых кислот.Во время использования они должны участвовать в экстракции и считаться заразными.С ними следует обращаться и утилизировать в соответствии с действующими правилами.
Внутренним эталонным геном является человеческий ген RnaseP.
Условия хранения и срок годности
-20 ± 5 ℃, избегать повторного замораживания и оттаивания более 5 раз, срок действия 6 месяцев.
Применимый инструмент
С FAM/HEX/CY5 и другим многоканальным флуоресцентным ПЦР-прибором.
Требования к образцу
1. Применимые типы образцов: мазки из зева, мазки из носоглотки, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, мокрота.
2. Сбор образцов (асептическая техника)
Мазок из зева: протрите миндалины и заднюю стенку глотки двумя мазками одновременно, затем погрузите головку мазка в пробирку с раствором для взятия проб.
Мокрота: после того, как у пациента появится сильный кашель, соберите мокроту от кашля в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую раствор для отбора проб;жидкость бронхоальвеолярного лаважа: забор проб медицинскими работниками.3. Хранение и транспортировка образцов
Образцы для выделения вируса и анализа РНК следует тестировать как можно скорее.Образцы, которые можно обнаружить в течение 24 часов, можно хранить при температуре 4℃;те, которые не могут быть обнаружены в течение 24
часов следует хранить при температуре -70 ℃ или ниже (если нет условий хранения -70 ℃, они должны быть
временно хранится в холодильнике -20℃).Следует избегать многократного замораживания и оттаивания образцов во время транспортировки.Образцы должны быть отправлены в лабораторию как можно скорее после сбора.Если образцы необходимо транспортировать на большие расстояния, рекомендуется хранить их на сухом льду.
Методы испытаний
1 Обработка проб и выделение РНК (зона обработки проб)
Для выделения РНК рекомендуется взять 200 мкл жидкого образца.Соответствующие этапы выделения см. в инструкциях к коммерческим наборам для выделения РНК.И отрицательный, и отрицательный
контроли в этом наборе участвовали в экстракции.
2 Подготовка реагентов для ПЦР (зона подготовки реагентов)
2.1 Удалите все компоненты из набора, разморозьте и перемешайте при комнатной температуре.Отцентрифугируйте при 8000 об/мин в течение нескольких секунд перед использованием;рассчитывают необходимое количество реагентов и готовят реакционную систему, как показано в следующей таблице:
| Компоненты | Порция N (система 25 мкл) |
| Праймер nCOV, смесь зондов TaqMan | 18 мкл × N |
| Реакционный раствор для ОТ-ПЦР | 2 мкл × N |
| *N = количество протестированных образцов + 1 (отрицательный контроль) + 1 (nCOVположительный контроль) | |
2.2 После тщательного смешивания компонентов центрифугировать в течение короткого времени, чтобы вся жидкость со стенок пробирки стекла на дно пробирки, а затем аликвоту 20 мкл системы амплификации перелить в пробирку для ПЦР.
3 Отбор проб (зона подготовки образцов)
Добавьте 5 мкл отрицательных и положительных контролей после экстракции.РНК тестируемого образца добавляют в реакционную пробирку для ПЦР.
Плотно закройте пробирку и центрифугируйте при 8000 об/мин в течение нескольких секунд, прежде чем переносить ее в зону обнаружения амплификации.
4 ПЦР-амплификация (увеличенная область обнаружения)
4.1 Поместите реакционную пробирку в ячейку для образцов прибора и установите следующие параметры:
| этап | Цикл число | Температура(°С) | Время | коллекциясайт |
| Обеспечить регресстранскрипция | 1 | 42 | 10 минут | - |
| Предварительная денатурацияn | 1 | 95 | 1 мин | - |
| Цикл | 45 | 95 | 15 с | - |
| 60 | 30-е годы | Сбор данных |
Выбор канала обнаружения прибора: Выберите канал FAM, HEX, CY5 для сигнала флуоресценции.Для эталонного флуоресцентного НЕТ, пожалуйста, не выбирайте ROX.
5 Анализ результатов (Пожалуйста, обратитесь к экспериментальным инструкциям каждого прибора для настройки)
После реакции сохраните результаты.После анализа отрегулируйте начальное значение, конечное значение и пороговое значение базовой линии в соответствии с изображением (пользователь может настроить в соответствии с реальной ситуацией, начальное значение может быть установлено на 3 ~ 15, конечное значение может быть установлено на 5~20, настройка) на логарифмическом графике. На пороге окна пороговая линия находится в логарифмической фазе, а кривая усиления отрицательного контроля представляет собой прямую линию или ниже пороговой линии).
6 Контроль Quauty (в тест включен процедурный контроль) Отрицательный контроль: нет очевидной кривой амплификации для каналов обнаружения FAM, HEX, CY5n
Положительный контроль COV: очевидная кривая амплификации каналов обнаружения FAM и HEX, значение Ct≤32, но нет кривой амплификации канала CY5;
Вышеуказанные требования должны выполняться одновременно в одном и том же эксперименте;в противном случае эксперимент недействителен и его необходимо повторить.
7 Определение результатов.
7.1 При отсутствии кривой амплификации или значения Ct > 40 в каналах FAM и HEX исследуемого образца, а в канале CY5 имеется кривая амплификации, можно судить об отсутствии нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) РНК в образце;
.2 Если тестовый образец имеет явные кривые амплификации в каналах FAM и HEX, а значение Ct ≤40, можно судить о том, что образец положительный на новый коронавирус 2019 года (2019-nCoV).
7.3 Если испытуемый образец имеет четкую кривую усиления только в одном канале FAM или HEX, а значение Ct ≤40, а в другом канале кривая усиления отсутствует, результаты необходимо проверить повторно.Если результаты повторного анализа согласуются, образец можно считать положительным для нового
коронавирус 2019 (2019-nCoV).Если результат повторного анализа отрицательный, можно сделать вывод, что образец отрицателен на новый коронавирус 2019 года (2019-nCoV).
Положительное значение оценки
Метод кривой ROC используется для определения эталонного значения CT набора, а эталонное значение внутреннего контроля составляет 40.
Интерпретация результатов испытаний
1.Каждый эксперимент должен быть протестирован на отрицательный и положительный контроль.Результаты испытаний могут быть определены только в том случае, если средства контроля соответствуют требованиям контроля качества.
2. Когда каналы обнаружения FAM и HEX положительны, результат от канала CY5 (внутренний канал управления) может быть отрицательным из-за системной конкуренции.
3. Когда результат внутреннего контроля отрицательный, если каналы обнаружения FAM и HEX пробирки также отрицательные, это означает, что система отключена или работа выполняется неправильно, тест недействителен.Таким образом, образцы должны быть проверены повторно.
