Продукты
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR Набор для обнаружения 2019-nCoV
Ожидаемое использование
Этот набор используется для качественного обнаружения нового коронавируса (2019-nCoV) с использованием мазков из горла, носоглотки, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, мокроты. Результаты обнаружения этого продукта предназначены только для клинической справки, и его не следует использовать в качестве единственного Доказательства для клинического диагноза и лечения. Рекомендуется комплексный анализ состояния в сочетании с клиническими проявлениями пациента и другими лабораторными исследованиями.
Принцип проверки
Набор основан на одноэтапной технологии RT-PCR.Фактически, гены ORF1ab и N нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) были выбраны в качестве целевых областей амплификации.Специфические праймеры и флуоресцентные зонды (зонды гена N помечены FAM, а зонды ORF1ab помечены HEX) предназначены для обнаружения РНК коронавируса нового типа 2019 года в образцах.В комплект также входит система обнаружения эндогенного внутреннего контроля (генный зонд внутреннего контроля, меченный CY5) для мониторинга процесса сбора образцов, амплификации РНК и ПЦР, тем самым снижая ложноотрицательные результаты.
Основные компоненты
| Компоненты | Объем（48Т/комплект） |
| Реакционный раствор RT-PCR | 96мкл |
| праймер nCOV, смесь зондов TaqMan (ORF1ab, ген N, ген RnaseP) | 864 мкл |
| Отрицательный контроль | 1500мкл |
| nCOV Положительный контроль (1 ген ORF1ab N) | 1500мкл |
Собственные реагенты: реагенты для экстракции или очистки РНК.Отрицательный/положительный контроль: Положительным контролем является РНК, содержащая целевой фрагмент, а отрицательным контролем является вода, не содержащая нуклеиновых кислот.Во время использования они должны участвовать в экстракции и должны считаться заразными.С ними следует обращаться и утилизировать в соответствии с действующими правилами.
Внутренним эталонным геном является ген RnaseP человека.
Условия хранения и срок годности
-20±5℃, избегайте повторного замораживания и оттаивания более 5 раз, действителен в течение 6 месяцев.
Применимый инструмент
С FAM/HEX/CY5 и другими многоканальными флуоресцентными приборами для ПЦР.
Требования к образцам
1. Применимые типы образцов: мазки из горла, мазки из носоглотки, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, мокрота.
2. Сбор образцов (асептическая техника).
Тампон из глотки: протрите миндалины и заднюю стенку глотки двумя тампонами одновременно, затем погрузите головку тампона в пробирку, содержащую раствор для отбора проб.
Мокрота: после того, как у пациента возникнет глубокий кашель, соберите кашляемую мокроту в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую раствор для отбора проб;Жидкость бронхоальвеолярного лаважа: отбор проб медицинскими работниками.3.Хранение и транспортировка образцов.
Образцы для выделения вируса и анализа РНК следует протестировать как можно скорее.Образцы, которые можно обнаружить в течение 24 часов, можно хранить при температуре 4 ℃;те, которые не могут быть обнаружены в течение 24
часы следует хранить при температуре -70 ℃ или ниже (если нет условий хранения при температуре -70 ℃, их следует хранить
временно храниться в холодильнике при температуре -20℃).Образцы следует избегать многократного замораживания и оттаивания во время транспортировки.Образцы следует отправить в лабораторию как можно скорее после сбора.Если образцы необходимо транспортировать на большие расстояния, рекомендуется хранить их в сухом льду.
Методы испытаний
1 Обработка проб и выделение РНК (участок обработки проб)
Для выделения РНК рекомендуется взять 200 мкл жидкого образца.Соответствующие этапы экстракции см. в инструкциях к коммерческим наборам для экстракции РНК.И отрицательные, и отрицательные
элементы управления в этом наборе участвовали в экстракции.
2 Подготовка реагентов для ПЦР (участок подготовки реагентов)
2.1. Достаньте все компоненты из набора, разморозьте и перемешайте при комнатной температуре.Центрифуга при 8000 об/мин в течение нескольких секунд перед использованием;рассчитывают необходимое количество реагентов и готовят реакционную систему, как показано в следующей таблице:
| Компоненты | Порция N (система 25 мкл) |
| праймер nCOV, смесь зондов TaqMan | 18 мкл × Н |
| Реакционный раствор RT-PCR | 2 мкл × Н |
| *N = количество протестированных образцов + 1 (отрицательный контроль) + 1 (nCOVположительный контроль) | |
2.2. После тщательного смешивания компонентов центрифугируйте в течение короткого времени, чтобы вся жидкость со стенок пробирки упала на дно пробирки, а затем аликвотируйте 20 мкл системы амплификации в пробирку для ПЦР.
3 Отбор проб (участок подготовки образцов)
После экстракции добавьте 5 мкл отрицательного и положительного контролей.РНК тестируемого образца добавляется в пробирку для реакции ПЦР.
Плотно закройте пробирку и центрифугируйте при 8000 об/мин в течение нескольких секунд, прежде чем перенести ее в зону обнаружения амплификации.
4 ПЦР-амплификация (усиленная зона обнаружения)
4.1 Поместите реакционную пробирку в ячейку для проб прибора и установите следующие параметры:
| этап | Цикл число | Температура(°С) | Время | коллекциясайт |
| Обеспечить регресстранскрипция | 1 | 42 | 10 минут | - |
| Предварительная денатурацияn | 1 | 95 | 1 мин | - |
| Цикл | 45 | 95 | 15 секунд | - |
| 60 | 30 лет | Сбор данных |
Выбор канала обнаружения прибора: выберите канал FAM, HEX, CY5 для сигнала флуоресценции.Для эталонной флуоресцентной лампы НЕТ, не выбирайте ROX.
5 Анализ результатов (для настройки обратитесь к экспериментальным инструкциям каждого прибора)
После реакции сохраните результаты.После анализа отрегулируйте начальное значение, конечное значение и пороговое значение базовой линии в соответствии с изображением (пользователь может настроить в соответствии с фактической ситуацией, начальное значение может быть установлено на 3 ~ 15, конечное значение может быть установлено на 5~20, регулировка) на логарифмическом графике. На пороге окна пороговая линия находится в логарифмической фазе, а кривая усиления отрицательного контроля представляет собой прямую линию или ниже пороговой линии).
6 Контроль качества (процедурный контроль включен в тест) Отрицательный контроль: нет очевидной кривой усиления для каналов обнаружения FAM, HEX, CY5n
Положительный контроль COV: очевидная кривая амплификации каналов обнаружения FAM и HEX, значение Ct≤32, но нет кривой амплификации канала CY5;
Вышеуказанные требования должны выполняться одновременно в одном и том же эксперименте;в противном случае эксперимент недействителен и его необходимо повторить.
7 Определение результатов.
7.1 Если в каналах FAM и HEX исследуемого образца отсутствует кривая амплификации или значение Ct > 40, а в канале CY5 имеется кривая амплификации, можно судить об отсутствии нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV). РНК в образце;
.2 Если исследуемый образец имеет очевидные кривые амплификации в каналах FAM и HEX, а значение Ct составляет ≤40, можно считать, что образец положителен на новый коронавирус 2019 года (2019-nCoV).
7.3 Если испытуемый образец имеет четкую кривую усиления только в одном канале FAM или HEX, а значение Ct составляет ≤40, а в другом канале кривая усиления отсутствует, результаты необходимо перепроверить.Если результаты повторного тестирования совпадают, образец можно считать положительным на новый
коронавирус 2019 (2019-nCoV).Если результат повторного теста отрицательный, можно сделать вывод, что образец отрицательный на новый коронавирус 2019 года (2019-nCoV).
Положительное суждение
Метод кривой ROC используется для определения опорного значения трансформатора тока комплекта, а опорное значение внутреннего контроля равно 40.
Интерпретация результатов испытаний
1. Каждый эксперимент должен быть проверен на наличие отрицательного и положительного контроля.Результаты испытаний могут быть определены только в том случае, если средства контроля соответствуют требованиям контроля качества.
2. Когда каналы обнаружения FAM и HEX положительны, результат канала CY5 (канал внутреннего управления) может быть отрицательным из-за конкуренции в системе.
3. Если результат внутреннего контроля отрицательный, если каналы обнаружения FAM и HEX пробирки также отрицательные, это означает, что система отключена или работает неправильно, тест недействителен.Поэтому образцы необходимо повторно протестировать.
