Продукция
Набор Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR для обнаружения 2019-nCoV
Ожидаемое использование
Этот набор используется для качественного выявления нового коронавируса (2019-nCoV) с использованием мазков из зева, мазков из носоглотки, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, мокроты. Результат обнаружения этого продукта предназначен только для клинической справки и не должен использоваться в качестве единственного доказательства для клинической диагностики и лечения. Рекомендуется комплексный анализ состояния в сочетании с клиническими проявлениями пациента и другими лабораторными тестами.
Принцип инспекции
Набор основан на одношаговой технологии ОТ-ПЦР. Фактически, гены ORF1ab и N нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) были выбраны в качестве целевых областей амплификации. Специфические праймеры и флуоресцентные зонды (зонды гена N маркированы FAM, а зонды ORF1ab маркированы HEX) предназначены для обнаружения РНК коронавируса нового типа 2019 года в образцах. Набор также включает эндогенную систему обнаружения внутреннего контроля (зонд гена внутреннего контроля маркирован CY5) для мониторинга процесса сбора образцов, РНК и ПЦР-амплификации, тем самым снижая ложноотрицательные результаты.
Основные компоненты
| Компоненты | Объем（48T/комплект） |
| Раствор для реакции ОТ-ПЦР | 96мкл |
| праймер nCOV, смесь зондов TaqMan (ORF1ab, ген N, ген RnaseP) | 864мкл |
| Отрицательный контроль | 1500мкл |
| nCOV Положительный контроль (1 ген ORF1ab N) | 1500мкл |
Собственные реагенты: реагенты для экстракции или очистки РНК. Отрицательный/положительный контроль: Положительный контроль — это РНК, содержащая целевой фрагмент, а отрицательный контроль — это вода без нуклеиновых кислот. Во время использования они должны участвовать в экстракции и должны считаться инфекционными. С ними следует обращаться и утилизировать их в соответствии с действующими правилами.
Внутренним референтным геном является ген RnaseP человека.
Условия хранения и срок годности
-20±5℃, избегать повторного замораживания и оттаивания более 5 раз, срок годности 6 месяцев.
Применимый инструмент
С FAM / HEX / CY5 и другими многоканальными флуоресцентными ПЦР-инструментами.
Требования к образцам
1. Применимые типы образцов: мазки из зева, мазки из носоглотки, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, мокрота.
2. Сбор образцов (асептическая техника)
Мазок из глотки: протрите миндалины и заднюю стенку глотки двумя тампонами одновременно, затем погрузите головку тампона в пробирку с раствором для взятия образца.
Мокрота: после того, как пациент сильно откашляется, соберите откашливаемую мокроту в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую раствор для взятия пробы; жидкость бронхоальвеолярного лаважа: взятие проб медицинскими работниками. 3. Хранение и транспортировка образцов
Образцы для изоляции вируса и тестирования РНК должны быть проверены как можно скорее. Образцы, которые могут быть обнаружены в течение 24 часов, могут храниться при температуре 4℃; те, которые не могут быть обнаружены в течение 24
часы следует хранить при температуре -70℃ или ниже (если условия хранения -70℃ отсутствуют, их следует хранить
временно хранить при температуре -20℃в холодильнике). Образцы следует избегать повторного замораживания и размораживания во время транспортировки. Образцы следует отправлять в лабораторию как можно скорее после сбора. Если образцы необходимо транспортировать на большие расстояния, рекомендуется хранение в сухом льду.
Методы испытаний
1 Обработка образцов и выделение РНК (зона обработки образцов)
Рекомендуется брать 200 мкл жидкого образца для извлечения РНК. Для соответствующих шагов извлечения см. инструкции коммерческих наборов для извлечения РНК. Как отрицательный, так и отрицательный
В экстракции участвовали контроли в этом наборе.
2 Приготовление реагентов для ПЦР (зона приготовления реагентов)
2.1 Извлеките все компоненты из набора, разморозьте и смешайте при комнатной температуре. Центрифугируйте при 8000 об/мин в течение нескольких секунд перед использованием; рассчитайте необходимое количество реагентов, и подготовьте реакционную систему, как показано в следующей таблице:
| Компоненты | Порция азота (система 25 мкл) |
| праймер nCOV, смесь зондов TaqMan | 18 мкл × N |
| Раствор для реакции ОТ-ПЦР | 2 мкл × N |
| *N = количество протестированных образцов + 1 (отрицательный контроль) + 1 (nCOVположительный контроль) | |
2.2 После тщательного перемешивания компонентов центрифугируйте в течение короткого времени, чтобы вся жидкость со стенок пробирки стекла на дно пробирки, а затем отберите 20 мкл амплифицирующей системы и перенесите ее в пробирку для ПЦР.
3 Отбор проб (зона подготовки образцов)
Добавьте 5 мкл отрицательного и положительного контролей после экстракции. РНК образца, который будет тестироваться, добавляется в пробирку для реакции ПЦР.
Плотно закройте пробирку и центрифугируйте при 8000 об/мин в течение нескольких секунд, прежде чем перенести ее в зону обнаружения амплификации.
4 ПЦР-амплификация (усиленная область обнаружения)
4.1 Поместите реакционную пробирку в ячейку для образца прибора и установите следующие параметры:
| этап | Цикл число | Температура(°С) | Время | коллекциясайт |
| Обеспечить регресстранскрипция | 1 | 42 | 10мин | - |
| Предварительная денатурацияn | 1 | 95 | 1мин | - |
| Цикл | 45 | 95 | 15с | - |
| 60 | 30-е годы | сбор данных |
Выбор канала обнаружения прибора: Выберите канал FAM、HEX、CY5 для сигнала флуоресценции. Для эталонного флуоресцентного сигнала NONE не выбирайте ROX.
5. Анализ результатов (для настройки обратитесь к экспериментальным инструкциям каждого прибора)
После реакции сохраните результаты. После анализа отрегулируйте начальное значение, конечное значение и пороговое значение базовой линии в соответствии с изображением (пользователь может отрегулировать в соответствии с фактической ситуацией, начальное значение может быть установлено в диапазоне от 3 до 15, конечное значение может быть установлено в диапазоне от 5 до 20, настройка) на логарифмическом графике. На пороге окна пороговая линия находится в логарифмической фазе, а кривая амплификации отрицательного контроля представляет собой прямую линию или ниже пороговой линии).
6 Контроль качества (в тест включен процедурный контроль) Отрицательный контроль: нет очевидной кривой амплификации для каналов обнаружения FAM, HEX, CY5
Положительный контроль COV: очевидная кривая амплификации каналов обнаружения FAM и HEX, значение Ct≤32, но нет кривой амплификации канала CY5;
Вышеуказанные требования должны быть выполнены одновременно в одном эксперименте; в противном случае эксперимент считается недействительным и его необходимо повторить.
7 Определение результатов.
7.1 Если в каналах FAM и HEX исследуемого образца отсутствует кривая амплификации или значение Ct > 40, а в канале CY5 имеется кривая амплификации, можно сделать вывод об отсутствии в образце РНК нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV);
.2 Если в исследуемом образце имеются очевидные кривые амплификации в каналах FAM и HEX, а значение Ct составляет ≤40, можно сделать вывод, что образец является положительным на новый коронавирус 2019 года (2019-nCoV).
7.3 Если тестовый образец имеет четкую кривую амплификации только в одном канале FAM или HEX, а значение Ct ≤40, а в другом канале кривая амплификации отсутствует, результаты необходимо перепроверить. Если результаты повторного тестирования совпадают, образец можно считать положительным для нового
коронавирус 2019 (2019-nCoV). Если результат повторного теста отрицательный, можно считать, что образец отрицателен на новый коронавирус 2019 (2019-nCoV).
Положительная оценка ценности
Для определения контрольного значения CT набора используется метод ROC-кривой, а контрольное значение внутреннего контроля равно 40.
Интерпретация результатов теста
1.Каждый эксперимент должен быть проверен на наличие отрицательного и положительного контроля. Результаты теста могут быть определены только тогда, когда контроль соответствует требованиям контроля качества.
2. Когда каналы обнаружения FAM и HEX положительны, результат канала CY5 (внутренний канал управления) может быть отрицательным из-за конкуренции систем.
3. Если результат внутреннего контроля отрицательный, если каналы обнаружения FAM и HEX пробирки также отрицательные, это означает, что система отключена или операция выполнена неправильно, тест недействителен. Поэтому образцы необходимо повторно протестировать.
